名称与用途

    本HEV IgM抗体ELISA试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒 IgM抗体。

前言与介绍

那些不是由HAV和HBV引起的肝炎在早期都被叫做非甲和非乙型肝炎。第一个被确定的传染性非甲和非乙型肝炎的病原体是导致现在叫做丙型肝炎的病毒HCV。接下来发现的是经粪便和消化道传染的被称为戊型肝炎的病原体HEV。戊型肝炎是指经肠道传染的非甲和非乙型肝炎。

戊型肝炎流行于整个世界，但据报道主要发生在发展中国家和地区，它们主要是南亚、中亚、非洲、墨西哥和中美洲。在这些国家和地区，被污染的水源是主要的传播媒介。尽管HEV和HAV在传染方面的特性是相似的，但它们在临床学、病原学和流行病学方面的特征是相互不同的。特别是在死亡率方面，HEV患者为1-2%，是HAV的10倍或10倍以上。对孕妇而言，HEV感染是非常致命的，被HEV感染的孕妇死亡率可高达19-20%。

本HEV IgM抗体ELISA试剂盒是一个应用合成多肽作抗原来检测人类血清和血浆内HEV IgM抗体的免疫分析试剂盒。这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。本试剂盒就是以这些抗原性很强的HEV特异性抗原作为固相吸附剂进行免疫分析的，使用合成抗原能在很大程度上减少由于使用重组抗原而造成的非特异性反应，这是因为重组抗原中混杂有其表达系统所产生的可能与抗体发生交叉反应的物质。

O.D.值大于或等于Cut-off值的样品为初试阳性，初试阳性的样品应该进行双份复检，双份复检都为阴性的被视为HEV IgM抗体阴性，双份复检中的任意一份为阳性，都被视为复检阳性。

检测原理

本HEV IgM抗体 ELISA试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB（3，3’，5，5’-四甲基联苯胺）底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长:  450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体ELISA试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。

试剂盒所提供试剂

所有的成份都应贮存于4⁰C，并注意标签上的有效期。

                                                                              96人份

1．包被板（EL2M-1）                                                             96孔

   已包被了人工合成的HEV混合多肽。

2. 酶结合物（EL2M -2）                                                          0.2ml

    标记山羊抗人-IgM抗体的辣根过氧化物酶(红色)，使用必须用工作稀释液稀释100倍。

3. 空白对照（EL2M -3）                                                            1ml

    （黄色）

4.阴性对照（EL2M-4）                                                              1ml

  经样品稀释液稀释的 灭活正常人血清（绿色）。

5.阳性对照（EL2M-5                                                               1.8ml

  经样品稀释液稀释的灭活HEV抗体阳性的人血清(红色)。

6.酶结合物稀释液（EL2M -6）                                                       20ml      

  （红色）。

7.样品稀释液（EL2M -7）                                                           15ml      

  （蓝色）。

8.洗涤液（20倍）（EL2M -8）                                                        60ml       

  20倍浓缩的表面活性剂。

9.底物A（EL2M -7）                                                               10ml

   H₂O₂缓冲液。

10.底物B（EL2M -7）（EL4-10）                                                     10ml

   TMB缓冲液。

11.终止液（EL2M -7）（EL4-11）                                                     14ml

2NH₂SO₄溶液。

试剂盒未提供，需用户自备材料

1．5-100μl，50-200μl单孔或者多孔精密可调微量移液器。

2．移液管：1ml、5ml、10ml、25ml。

3．吸头贮存盒或相应的容器。

4．试管和试管架。

5．聚丙烯管或容器（25ml）。

6．三角瓶：100ml、400ml、1000ml、2000ml。

7．温箱：37+2℃。

8．酶标仪：450nm+2nm。

9．自动微孔板洗涤机或喷射瓶。

10．次氯酸钠盐溶液5.25%（家庭用液体漂白剂）。

11．去离子水或蒸馏水。

12．塑料盘盖。

13．一次性手套。

14．吸水纸。

注意事项

1．  不同试剂盒的物品不可混用，为取得最佳效果每盒内的对照、酶结合物和包被板是相互配套的，请不要使用非生产商提供的试剂。

2．  使用前必须将试剂和材料恢复到室温（20—25⁰C），不能用水浴融化样品或试剂。

3．  不要使用超过有效期的试剂盒。

4．  只能用去离子水或蒸馏水稀释试剂。

5．  不用时不要将包被板从贮存盒中取出，不用的板条应连同干燥剂一起放回袋中贮存于2-8℃。

6．  每次取液应用不同的吸头以免交叉污染。

7．  勿将酸与次氯酸钠溶液混和。

8．  应当把人血清或血浆看作是具有潜在传染疾病能力的危险品。在检验时必须戴一次性手套保护，因为并不知道所测试的血液是否不会传染疾病，所以应把所有的血液及其制品当作是潜在的传染源，并且严格遵守实验室规则。

9．  用过的所有物品都必须按规定处理以消毒灭菌。

固态废物：121⁰C高压60分钟。

液态废物；加入次氯酸钠使终浓度为1.0%，消毒30分钟。

10．底物容易被污染，如果在使用之前已出现蓝色，那么该底物就不能继续用。

11．底物B含有20%丙酮，应注意防火。

12．浓缩洗涤液（20x）放在低温（2—5⁰C）时易形成结晶析出，如有结晶出现，请在使用前于37⁰C溶解。

样品准备（收集、处理和贮存）

a.血清；应用标准采血技术抽血，有条件时应立即将血清和血细胞分离。样品在室温下静置1小时后，在4℃离心10分钟后，即可析出血清。

b.血浆:应用标准采血技术抽血,用柠檬酸钠、EDTA或肝素抗凝，为确保良好的重复性和减少血小板污染，血浆分离必须在采血后冰浴不超过30分钟内完成，然后在4℃离心10分钟以除去各种颗粒。本试剂盒不受标本的溶血作用影响，柠檬酸钠，EDTA或肝素等抗凝物一般不会产生不良作用。

l          标本应避免大量溶血，脂质或混浊。

l          血清和血浆可在2-8⁰C贮存24-48小时，更长时间则应贮存于-20⁰C，以避免丢失生物活性和污染。绝对不能反复冻融。

l          检验前应将样品恢复到室温。

l          建议所有的样品都重复化验一次。

l          样品不得加热处理。

试剂准备

从冰箱里拿出试剂盒并恢复到室温20-25⁰C，在用前轻轻搅拌均匀，但不得搅起泡沫。

1．  空白对照、阴性对照和阳性对照；盒子里的阴阳对照已经经过稀释，不必再进行稀释。

2．  洗液：用蒸馏水或去离子水稀释浓缩洗涤液成终体积为1200ml，充分混匀；如果只要小量的洗液，只需按1：20稀释，洗液在室温下可贮存2周，2-8⁰C可存储1个月，用前要摇匀。

3．  底物溶液：在用前15分钟等体积混合A、B液，参照下表：

4. 酶连接物工作溶液：在使用前10-30分钟，把红色的酶连接物溶液恢复到室温，然后按照下表推荐的体积用酶连接物稀释液（红色）以1：100的比例稀释酶连接物，充分混合，并在4小时之内用完。

分析过程：

1、   在分析过程开始之前，准备好洗涤缓冲液和各种对照品（见试剂准备），建议加样品和标准品时参考本说明书所提供的表格。下表为加标准品和样品时所推荐使用的表格

2、   将100微升空白对照（黄色）、阴性对照（绿色）和阳性对照（红色）加入相应位置的微孔内。

3、   在微孔板上用样品稀释液对样品进行（1：20）稀释，并孵育，具体操作如下：

（i）加95μl样品稀释液到相应板孔内；

（ii）加5μl样品到相应的孔中；

（iii）把稀释液和样品及对照液轻轻振动。

（iiii）盖上板盖，并在37±2℃下孵育30分钟。

4、   在洗涤微孔板之前，配制工作酶连接物溶液（见试剂准备）。

5、   选用一种下面提供的方法洗涤微孔板

人工洗涤：把孵育的混合物倒入废物桶内，在每一孔内加满洗涤液，然后把其倒入废物桶内，重复洗涤，共洗涤5次。最后一次洗涤后，把微孔板在吸水纸上拍干。注意不要使板条从板架上掉下而导致错位。

自动洗涤：吸干所有的微孔，然后按照下面推荐的方法用洗涤液洗涤，调节洗板机使孔内余水量最小，每孔每次加洗涤液350微升（范围350-400微升），建议设置10秒的洗涤时间和5秒的洗涤间隔振动时间，共洗涤5次。洗涤完毕后反转微孔板，在吸水纸上摔干直到没有水珠粘附。

6、   在每孔内加入100微升（2滴）酶结合物（注意加酶结合物时，要使试剂瓶垂直向下），轻敲微孔板，使内容物充分混合，加盖，37±2℃下孵育30分钟。

7、   底物溶液制备（见试剂制备），在第二次孵育结束之前15分钟之内混合。

8、   按照步骤5的方法重复洗板。

9、   在每孔内加底物100微升，加盖，37±2℃下孵育15分钟。

10、在每孔内加终止液100微升，轻敲微孔板使内容物充分混合。

11、在30分钟内，用酶标仪在450纳米处测出光密度（O.D.值）。

质量控制

1. 每次每板都应设置两个空白对照，两个阴性对照，三个阳性对照。

2. 空白对照O.D.值应≤0.10。

3. 减去空白对照O.D.值后，必须做到0≤两个阴性对照的O.D值.≤0.15。

4. 减去空白对照O.D.值后，三个阳性对照中至少应有两个的O.D. 值在0.6≤O.D.值≤2.0之间。

5. 两个或更多阳性对照O.D.值不得相差30%以上，否则应重新检测。

6. 为了确保分析过程有效，阳性对照的O.D.平均值与阴性对照的O.D.平均值之差不得小于0.500，如果该值连续小于0.500,那么就应该考虑检测操作的技术问题了。

结果计算方法

1. 在判断结果前必须将所有对照和样品的O.D.值减去空白对照的O.D.值。

2. 如果每次不止检测一块板，则各板间应单独计算，然后判断结果。

3. 通过CUT-OFF值来判断有无HEV IgM抗体的存在。

结果计算举例

1. 空白对照（BC）O.D. 平均值。

例如：孔号                                O.D.

      A1                                0.022                      

      B1                                0.024

      和                                0.046

      平均                                0.046/2=0.023（BC O.D. 平均值）

2. 阴性对照（NRC）平均O.D.值:

举例：孔号            O.D.                      减去空白对照                                       

      C1              0.060                             0.037

      D1              0.062                             0.039                      

      和                                                     0.076                      

      平均                              0.076/2=0.038（NRC O.D. 平均值）

3. 阳性对照（RC）O.D平均.值

举例：孔号                 O.D.                            减去空白对照       

      E1                          1.201                             1.178                      

      F1                          1.207                              1.184                      

      G1                          1.198            1.175

      和                                                                    3.537

      平均                                                               3.537/3=1.179 (RC  O.D. 平均值)

4. RC  O.D. 平均值与 NRC  O.D. 平均值之差

 举例：RC  O.D. 平均值                                1.179

       NRC O.D. 平均值                                0.038

       差值                                1.179-0.038=1.141

5. CUT-OFF值

 CUT-OFF值= NRC  O.D. 平均值 +  0.20

 举例：NRC O.D. 平均值                                0.038

       CUT-OFF值                                0.038+0.20=0.238

结果判断

1、   O.D.值低于CUT OFF值的样品，被认为是阴性,不必再测。

2、   O.D.值大于或等于CUT OFF值的样品，被认为是阳性，但在报之告前应双份重复再做一次。

3、   如果重复实验发现任何一份仍然为阳性，则认为样品中含有HEV IgM有抗体，即为阳性。